PENGEMBANGAN VALIDASI METODE ANALISIS

 

1. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada pengembangan metode analisis

•       = Tahap karakterisasi analit

    Karakterisasi analit dapat mencakup pengumpulan informasi tentang analit dan sifat fisikokimia meliputi struktur, toksisitas, kemurnian, higroskopisitas, stabilitas dan cara penyimpanan

•       Tahap penilaian kebutuhan metode

    Kebutuhan metode merupakan tujuan atau target metode yang akan dikembangkan, diantaranya meliputi batas deteksi, selektivitas, linieritas, rentang, kecermatan dan keseksamaan. Faktor yang perlu dipertimbangkan meliputi waktu, biaya dan tenaga, ketersediaan instrumentasi dan biaya per analisis.

•       Tahap penelusuran pustaka

      Penelusuran pustaka yang berhubungan dengan analisis dan metode analisis yang sesuai, penelusuran ini dapat dilakukan melalui buku, publikasi ilmiah lainnya, dan dapat juga dilakukan secara komputerisasi jika mungkin. Penelusuran dapat mencakup data kompilasi, laporan, hasil catatan, dan publikasi, berkomunikasi dengan sejawat yang bekerja pada topik yang sama, atau metode yang mungkin dipublikasikan.

•       Tahap memilih metode

      Jika mungkin melakukan adaptasi sehingga lebih efisien, dan/atau dengan memodifikasi metode yang sudah ada. Adaptasi dapat mencakup kondisi preparasi maupun kondisi instrumentasi. Jika tidak terdapat metode untuk analit yang sama, maka dapat dipilih analog senyawa yang sama yang mempunyai sifat yang sama.

•       Tahap penyiapan alat dan studi pendahuluan

      Menyiapkan analisis dengan instrument yang sesuai dengan prosedur operasional baku alat, diusahakan menggunakan bahan habis pakai dan menggunakan yang baru seperti penyaring dan pelarut. Analisis dimulai dengan mencoba sesuai dengan kondisi analisis yang ada pada pustaka. Hasil percobaan pendahuluan selanjutnya dikaji ulang.

•       Tahap optimasi

      Proses optimasi dilakukan jika hasil studi pendahuluan jauh dari yang diharapkan, dalam hal ini untuk mencari aras-aras yang optimum, dengan mengubah parameter-parameter yang mempengaruhi analisis sampai diperoleh kondisi yang paling baik. Harus dipastikan kondisi analisis dapat sesuai untuk pemakaian analit dalam matriks.

•       Tahap unjuk kerja metode dengan larutan baku (uji kesesuaian sistem)

     Unjuk kerja dilakukan dengan metode yang sudah dioptimasi sebelum ke sampel yang sebenarnya. Unjuk kerja metode diuji dengan larutan baku, meliputi batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas, biaya per analisis, penyiapan sampel. Unjuk kerja metode KCKT dapat juga dilakukan dengan memastikan homogenitas senyawa pada puncak dimaksud misalnya dengan detector Photo Diode Array, spektrofotometri massa, atau spektrofotometri inframerah.

2. Parameter uji kesesuaian sistem 

a. Penentuan Sistem Presisi
Setelah larutan baku diinjeksikan beberapa kali, simpangan baku relatif (relative Standard deviation, RSD) respon puncak dapat diukur, baik sebagai tinggi puncak atau luas puncak. Menurut monograp Farmakope Amerika, selain dinyatakan lain, sebanyak 5 kali injeksi harus dilakukan jika dinyatakan nilai RSD yang disyaratkan adalah ≤ 2,0 %; sementara itu jika dinyatakan nilai RSD boleh lebih besar dari 2,0 %, maka dilakukan 6 kali replikasi injeksi.

B. Resolusi (daya pisah)

    Dalam kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan (Δt_R = t_R2-t_R1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W₁ + W₂)/2 seperti gambar berikut.

C. Faktor asimetri (Faktor pengekoran)

D. Efisiensi Kolom 
Ukuran efisiensi  kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi

E. Kapasitas kolom

3. Persyaratan nilai uji kesesuaian sistem

a. system presisi = RSD ≤ 2%

b. Nilai Rs = mendekati atau lbh 1,5

c. faktor asimetri = jika TF =1 berarti simetris , kalau TF >1 terjadi pengokoran

4. Mengapa perlu dilakukan pengembangan metode analisis

1. Tidak ada metode analisis yang sesuai untuk analit tertentu dalam matriks sampel yang khusus
2. Metode yang ada mengandung galat dan pengganggu analisis, shg tidak lagi reliable, dan menampakkan kecermatan dan keseksamaan yang rendah
3. Metode yang ada terlalu mahal, membutuhkan waktu yang lama, sumber energy yang banyak, dan tidak dapat diotomatisasikan
4. Metode yang ada tidak memberikan kepekaan dan keselektifan dalam sampel dan matriks yang dimaksud
5. Terdapat teknik dan instrument baru yang membutuhkan pembuktian kinerja metode analisis
6. Adanya kebutuhan untuk menggunakan metode alternative yang teruji kinerjanya

5. Tahapan pengembangan metode analisis

Tahap I = pengembangan dan perancangan

= a. Menentukan masalah analisis, berkaitan dg apa yang akan dilakukan (penentuan kualitatif, kuantitatif, / uji batas)
b. Mengumpulkan informasi berkaitan dg masalah analisis di atas
Sampel (analit dan matriks)
Metode analisis yang ada
Instrument yang tersedia
Perlakuan awal
Metode baku
Persyaratan yang telah ditentukan
c. Menyusun kriteria pemilihan metode
Kriteria numerik
Kriteria ekonomis
Kriteria kepraktisan

d. Pemilihan dan disain metode analisis berdasarkan informasi dan kriteria

tahap II = Design percobaan dan optimasi

6. Mengapa pelu dilakukan validasi dan verifikasi metode analisis

= Verifikasi sebuah metode bermaksud untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid

• Untuk membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja.
• Hal ini dikarenakan laboratorium yang berbeda memiliki kondisi dan kompetensi personil serta kemampuan peralatan yang berbeda, sehingga, kinerja antara satu laboratorium dengan laboratorium lainnya tidaklah sama.

7. Parameter validasi metode (pelajari definisi, cara penentuan dan perhitungan: kecermatan, keseksamaan, Batas Detesi, Batas Kuantitasi)

= a. Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya.

Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis.

Cara penentuan :

Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).

Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia Certified Reference Material atau Standard Reference Material) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).

Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).

b. Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.

Cara penentuan :

Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi).

Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility).

Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal.

Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang.

c. Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas.

Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

Cara penentuan :

Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat.

Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan :

Q = k x Sb/ Sl

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi

Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

Share this post