FARMAKOGNOSI : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

               Kromatografi lapis tipis adalah salah satu bentuk kromatografi planar yang pemisahannya menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Pada umumnya, kromatografi lapis tipis secara luas digunakan untuk dua tujuan yaitu :

a.       Sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif dan preparatif;

b.       Digunakan untuk menentukan kondisi yang sesuai untuk pemisahan pada kromatografi kolom ataupun kromatografi cair kinerja tinggi (1)

Prinsip dari kromatografi lapis tipis  yaitu analit akan bergerak melintasi lapisan fase diam yang dibawah pengaruh fase gerak yang bergerak melewati  fase diam. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar partisi kedalam fase diam gel silika sehingga semakin sedikit waktu yang dibutuhkan fase gerak untuk bergerak menyusuri plat dan semakin pendek jarak tempuh senyawa menaiki plat dalam waktu tertentu (2). Dengan adanya perbedaan sifat fisik dan kimia dari senyawa molekul untuk melekat pada permukaan (adsorbsi/penjerapan). Prinsip kelarutan yang dipakai yaitu like dissolve like  artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa yang polar dan pelarut non-polar akan melarutkan senyawa non-polar (3).

2.       Adapun Jenis-jenis kromatografi yaitu :

a.       Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran yang tidak volatil. Kromatografi lapis tipis dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil yang dilapisi dengan lapisan tipis bahan adsorben, biasanya silika gel, aluminium oksida, atau selulosa. Setelah sampel diaplikasikan pada pelat, suatu pelarut atau campuran pelarut (dikenal sebagai fase gerak) dialirkan ke atasa melalui pelat berdasarkan gaya kapilaritas. Oleh karena itu, analit yang berbeda mengalir menaiki pelat KLT dengan laju yang berbeda, maka terjadilah pemisahan komponen dalam analit tersebut (4).

b.       Kromatografi kolom

Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dan kemudian membuang fasa diam yang telah digunakan. Kemudahan pembuangan fase diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fasa diam akibat pemakaian ulang atau daur ulang.  Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 cm dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca untuk mencegah hilangnya fase diam) pada bagian bawah. Dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom yaitu metode kering dan metode basah (4).

c.       Kromatografi Gas

Kromatografi gas adalah jenis kromatografi yang umum digunakan dalam analisis kimia untuk pemisahan dan analisis senyawa yang dapat menguap tanpa mengalami dekomposisi. Penggunaan umum kromatografi gas mencakup pengujian kemurnian senyawa tertentu, atau pemisahan komponen berbeda dalam suatu campuran (kadar relatif komponen tersebut dapat pula ditentukan). Dalam beberapa kondisi, kromatografi gas dapat membantu mengidentifikasikan senyawa. Secara, prinsip kromatografi gas sama dengan kromatografi kolom (sama juga dengan kromatografi jenis lainnya seperti KCKT dan KLT) namun terdapat beberapa perbedaan yaitu proses pemisahan campuran terjadi antara fase diam cairan dan fase gerak gas dibandingkan kromatografi kolom. Selain itu, kolom yang dilalui fase gas terletak didalam oven dengan temperatur gas yang dapat dikendalikan serta konsentrasi senyawa dalam fase gas murni merupakan fungsi dari tekanan uap gas (4).

3.       Adapun jenis-jenisfase diam dan penggunaannya, sebagai berikut:

a.   Silica gel,

Silika gel memiliki mekanisme sorpsi adsorbpsi yang digunakan pada asam amino, alkaloid, asam-asam lemak, dan lain-lain (5).

b.  Silika yang termodifikasi dengan hidrokarbon, memiliki mekanisme sorpsi partisi termodifikasi yang digunakan pada senyawa-senyawa non-polar (5).

c.   Alumina, memiliki mekanisme sorpsi adsorbsi yang digunakan pada hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, dan alkaloid (5).

d.  Kielsghur, memiliki mekanisme sorpsi partisi yang digunakan pada gula dan asam-asam lemak (5).

e.   Serbuk selulosa, memiliki mekanisme sorpsi partisi yang digunakan pada asam amino, nukleotida dan karbohidrat (5).

f.   Selulosa penukar ion, memiliki mekanisme sorpsi penukar ion yang digunakan pada asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam (5).

g.  Gel sephadex, memiliki mekanisme sorpsi eksklusi yang digunakan pada polimer, protein, dan kompleks logam (5).

h.  β-siklodekstrin, memiliki mekanisme sorpsi interaksi adsorpsi streospesfik digunakan pada campuran enansiomer (5). 

4.       Perbedaan antara RP dan NP serta kapan masing-masing digunakan yaitu:

Pada Normal phases (NP), penggunaan fase diam polar yang dikombinasikan dengan berbagai fase gerak non polar. Tipikal fase diam yang sering dikatakan bersifat polar ialah silica gel, alumina dan berbagai material fase terikat polar lainnya seperti siano-silika dan diol-silika, dimana pada proses adsorbsi memainkan peran penting dalam pemisahan. Sedangkan fase gerak yang paling sering digunakan yaitu campuran hidrokarbon dengan pelarut yang terklorinasi atau pelarut-pelarut jenis alkohol seperti etileter, kloroform dan n-heksana yang bersifat non-polar. Lempeng Normal phases digunakan untuk senyawa nonpolar ketika dielusi lebih awal karena senyawa non polar paling baik kelarutannya dalam fase gerak sehingga peningkatan kepolaran fase gerak dapat memperpendek waktu elusi dengan artian kemampuan elusi meningkat dengan meningkatkannya polaritas pelarut (6).

Pada Reversed phases (RP), penggunaan fase diam nonpolar (biasanya suatu hidrokarbon) yang dikombinasikan dengan berbagai fase gerak polar seperti air, methanol atau asetonitril. Lempeng Reversed phase digunakan pada senyawa-senyawa polar karena akan terelusi lebih awal dan terjadi peningkatan kepolaran fase gerak akan memperbesar waktu elusi sehingga kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (6).

 

5.    Adapun mekanisme noda muncul pada UV 254 dan UV 366

Pada UV 254 nm, lempeng akan berflourosensi dan sampel akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 terjadi karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator flourosensi yang terdapat pada lempeng. Flourosensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron tereksitasi dari tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi (7). Jika senyawa pada bercak yang akan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik jenis apa saja, maka sinar UV yang mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator flourosensi, dan tidak ada cahaya yang dipancarkan sehingga hasil yang diperoleh bercak gelap dengan latar belakang yang bersinar (8).

Pada UV 366, noda akan berflourosensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan pada lampu 366 terjadi karena adanya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh gugus auksokrom yang ada pada noda tersebut. Flourosensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berflourosensi pada sinar UV 366 (7). Dapat dilihat pada UV 254 nm, lempeng akan berflourosensi (berwarna) dan sampel akan tampak berwarna gelap. Sedangkan Pada UV 366, noda akan berflourosensi dan lempeng akan berwarna gelap.

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 ialah berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi Visibel) sehingga noda menjadi tampak oleh mata (10).

Batokromik atau pergeseran merah adalah efek yang terjadi akibat perubahan absorbsi panjang gelombang ke arah panjang gelombang yang lebih besar. Hal ini tejadi karena adanya substituen/auksokrom tertentu pada kromofor. Misalnya pada pengukuran benzene atau dapat juga terjadi karena adanya perubahan pelarut. Sedangkan pada hipsokromik atau pergeseran biru adalah efek terjadinya perubahan pelarut atau tidak adanya substituen/auksokrompada suatu kromofor sehingga terjadi peningkatan intensitas absorbsi dan hipokrimik penurunan intensitas. Misalnya karena perubahan pelarut. Secara sederhana perubahan pergeseran panjang gelombang atau intensitas absorbsi digambarkan sebagai berikut (11).

8.       Cara mengaktifkan lempeng kromatografi lapis tipis yaitu sebelum digunakan Lempeng adsorben perlu diaktifkan terlebih dahulu didalam oven dengan suhu 120^oC-150^oC untuk menghilangkan air yang ada pada permukaan adsorben. Jika temperatur yang digunakan terlalu tinggi, akan menyebabkan lempeng adsorben non-aktif secara permanen. Setelah itu, lempeng fase diam dalam lingkungan yang tidak lembab atau bebas dari uap laboratorium (12).

DAFTAR PUSTAKA

(1)    Rollando. Senyawa Antibakteri dari Fungi Endofit. Malang : CV. Seribu Bintang. 2019.

(2)    Watson, D. Analisis Farmasi. Edisi Kedua. Jakarta: ECG. 2005.

(3)    Khopkar, S.M. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press. 2008.

(4)    Tim Smart Nusantara. Strategi Kuasai Kimia. Jakarta: Gramedia Widiasarana. 2017.

(5)    Gandjar, Ibnu Gholib dan Rohman, A. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka pelajar. 2017.

(6)    Susanti, M. dan Dachriyanus. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang : Lembaga Pengembagan Teknologi Informasi dan Komunikasi (LPTIK) Universitas Andalas. 2017.

(7)    Sudarmadji, S. Teknik Analisis Biokimia. Yogyakarta: Liberty Yogyakarta. 1996.

(8)    Gritter, R.J., Robbit., J.M., dan Schwarting. Pengantar Kromatografi. Edisi kedua. Terjemahan Kokasih Padmawinata. Bandung : Institut Teknologi Bandung. 1991.

(9)    Sopiah, B., dkk. Skring Fitokimia dan Potensi Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Hijau dan Ddaun Merah Kastuba. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia.2019.

(10)   Soebagio., dkk. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Malang. 2000.

(11)  Suhartati, T. Dasar-Dasar Spektrofotometri UV-Vis dan Spektrofotometri Massa untuk Penentuan Struktur Senyawa Organik.Lampung: Penerbit AURA. 2017.

(12)  Secoadi, R. Uji Kemampuan Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri untuk Memisahkan Asam Salisilat dan Eugenol. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma. 2012.

Share this post