Farmakognosi : Kromatografi Kolom Konvensional/Kromatografi Kolom Cair Vakum

 

           Kromatografi kolom konvensional merupakan suatu metode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya adsorben terhadap suatu senyawa, baik pada pengotor maupun hasil isolasinya berdasarkan adsorpsi dan partisi. Prinsip kerja kromatografi kolom konvensional ialah perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu dimasukkan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Dimana, senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa nonpolar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Sementara, pelarut lebih lanjut/dengan tanpa tekanan udara masing masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusu sehingga terjadi pemisahan pada kolom (1).

            Kromatograpi kolom cair vakum adalah bentuk kromatografi kolom yang khusus berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak, dimana metode ini banyak digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non-polar atau ekstrak semipolar. Suction coloumn merupakan alat kromatografi kolom serapan sehingga prinsip pemisahannya sama dengan kromatografi kolom serapan yang didasarkan pada adsorbsi dan partisi yang dipercepat dengan isapan pompa vakum (2).

  Perbedaan antara kromatografi kolom konvensional dan kromatografi cair vakum serta keuntungan dan kerugian yaitu:

            Kromatografi kolom konvensional merupakan metode kromatografi yang banyak digunakan untuk memisahkan beragam jenis sampel dengan metode yang relatif mudah dilakukan karena peralatannya yang sederhana yaitu hanya menggunakan kolom (3).  Sedangakan Kromatografi vakum cair (KCV) merupakan metode kromatografi yang menggunakan vakum (2). Adapun keuntungan KCV yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu (4):

a. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensionalkarena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase grak lebih lambat (10-100µL/menit)

b.   Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa

c.   Sensitivitas kolom mikroboor ditingkatkan karena solute lebih pekat sehingga jenis kolom KCV sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas. Misalnya sampel kritis.

Tedapat perbedaan silika yang digunakan pada kromatografi kolom konvensional dankromatografi cair vakum yaitu:

a.       Kromatografi kolom konvensional

Pada kromatografi kolom konvensional, Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam (5):

ü  Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapaskemudian ditambahkan cairan pengelusi.

ü  Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yangakan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

b.       Kromatografi kolom cair vakum

Pada kromatografi kolom cair vakum, Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu (6):

ü  Cara Basah

Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan.

ü  Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan. Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama.

4.   

            Dalam preparasi kolom, ada dua metode yaitu metode kering dan metode basah (7).

a.       Metode kering

Pada metode kering yaitu kolom pertama kali diisi dengan serbuk kering fasa diam, kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga seluruh kolom terbasahi. Mulai titik ini, fasa diam tidak diperkenankan mengering (7).

b.       Metode Basah

Pada metode basah yaitu fasa diam dibasahi dengan fasa gerak hingga menjadi bubur diluar kolom, dan kemudain dituangkan perlahan-lahan kedalam kolom. Pencampuran dan penuangan harus ekstrak hati-hati untuk mencegah munculnya gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan dibagian atas fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapirsan organik dari tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferis atau corong pisah tersumbat yang sudah dielusi diletakkan dibagian atas kolom (7).

Berikut cara kerja dari kromatografi kolom konvensional dan kromatografi cair vakum:

a.       Kromatografi kolom konvensional (8) (9)

1.    Alirkan fase gerak yang berupa cairan kedalam kolom sehingga akan membawa cuplikan senyawa melalui fase diam sehingga akan terjadi proses adsorbsi. Cepat lambatnya proses pemisahan terjadi bergantung pada banyak atau besarnya sampel yang digunakan

2.     Hasil akhir fraksi-fraksi senyawa (eluat) akan ditampung dibawah kolom

b.       Kromatografi Cair Vakum (10)

1.  Dalam pemisahan bahan alam menjadi fraksi-fraksi sampai diperoleh senyawa murni, tahapan awal yang harus dilakukan ialah partisi atau fraksinasi ekstrak kasal hasil maserasi.

2.       Siapkan terlebih dahulu silika (7731) pada kolom KCV yang berdiameter besar.

3.   Tuangkan pelarut diatas kolom, hingga pelarut akan turun dengan cepat karena adanya tarikan dari penghisap (vakum)

4.       Pada kolom penampung, terdapat hasil pemisagan sementara

5.       Pemisahan ditampung pada botol-botol

DAFTAR PUSTAKA

(1)    Sastroamidjojo, A.Seno. Obat Asli Indonesia. Cet. V. Jakarta : Penerbit Dian Rakyat. 1997.

(2)    Gritter, R.J., Bobbit, J.M., dan Swharting, A.E. Pengantar Kromatografi. Ed. Kedua. Bandung : Penerbit ITB. 1991.

(3)    Widiastuti, E. dan Sri M., Edi Wahyu. Pengembangan Modul Kromatografi untuk mendukung Kegiatan Belajar Mengajar di Prograf Studi D-III Analisis Kimia. Jurnal Fluida. Vol. 9 (1). 2013.

(4)    Kasiman, Peranginangin. Metode ekstraksi tumbuhan . Yogyakarta: Penerbit Kanikus. 2006.

(5)    Harborne, J. B. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan . Bandung :Institut Teknologi Bandung. 1987.

(6)    Sarker, S.D., Latif, Z., and Gray, A.L. Natural Product Isolation. New Jersey: Humana Press. 2006.

(7)    Tim Smart Nusantara. Strategi Kuasai Kimia. Jakarta: Gramedia Widiasarana. 2017.

(8)    Rubiyanti, Dwiarso. Metode Kromatografi: Prinsip Dasar, Praktikum dan Pendekatan Pembelajaran Kromatografi. Yogtakarta : Deepublish Publisher. 2017.

(9)    Oxtoby, David W, H.P. Gillis & Norman H. Nachtrieb. Prinsip-Prinsip Kimia Modern Edisi keempat. Jakarta : Penerbit Erlangga. 2001.

(10)  Harini, Noor, Renita Marianty & Vritta Amroini Wahyudi. Analisis Pangan. Sidoarjo : Zifatama Jawara. 2019.

Share this post